什么是高效液相色譜法？
??HPLC（高效液相色譜）是一種利用色譜柱和樣品之間的相互作用來分離和檢測樣品中所含每種化合物的方法。由于它易于測量并且可以檢測痕量成分，因此被應(yīng)用于多種行業(yè)，包括制藥、生物化學(xué)、食品和環(huán)境。
另外，由于HPLC的峰面積與樣品濃度成正比關(guān)系，因此還可以定量樣品中所含成分的濃度。請注意，HPLC 中樣品的分離行為因色譜柱和流動相而異，因此需要設(shè)計適當?shù)姆治鰲l件。
如何使用和使用高效液相色譜法
HPLC（高效液相色譜）是一種利用色譜柱和樣品之間的相互作用來分離樣品中各成分的分析方法。使用非常方便，直接注入樣品溶液或?qū)悠啡芤悍湃?/font>自動進樣器中進行批量處理即可進行分析。
HPLC 用于各個行業(yè)。例如，在制藥領(lǐng)域，用于分析微量雜質(zhì)和活性成分；在食品、飲料、環(huán)境領(lǐng)域，用于分析營養(yǎng)成分、功能成分、添加劑、殘留農(nóng)藥；在生物化學(xué)、用于分析蛋白質(zhì)和核酸相關(guān)物質(zhì) 用于分析物質(zhì)。
HPLC 原理和所用色譜柱
HPLC 和氣相色譜 (GC) 是色譜法的類型。色譜法是使分析對象物中含有的各化合物一邊被吸附一邊通過色譜柱，根據(jù)各成分的吸附力的差異進行分離的方法。樣品成??分流動的介質(zhì)（例如 HPLC 溶劑和 GC 氣體）稱為“流動相”，而吸附樣品的材料（例如色譜柱）稱為“固定相”。
樣品和色譜柱中所含組分之間相互作用的類型和程度根據(jù)色譜柱的類型而有所不同。例如，ODS 柱用烷基鏈（十八烷基）修飾，通過疏水相互作用吸附樣品。
另一方面，在硅膠柱中，表面的硅烷醇基團吸附極性化合物。此外，還有苯基、氰基、氨基修飾的色譜柱。
使用 HPLC 峰面積計算濃度
HPLC 峰面積與樣品濃度成正比。然而，使用紫外檢測器時，即使樣品濃度相同，峰面積也會根據(jù)消光系數(shù)（吸收光的容易程度）而變化。因此，使用HPLC進行濃度分析時，需要準備標準物質(zhì)來比較面積。
濃度分析的一種方法是“外標法”。在該方法中，制備多個已知濃度的標準樣品，并進行 HPLC 分析以確定峰面積。由于每個樣品的濃度是已知的，通過繪制面積值和濃度，可以獲得根據(jù)面積值計算濃度的公式。
第二種方法是“內(nèi)標法”。在此方法中，將另一種化學(xué)和物理穩(wěn)定的化合物作為內(nèi)標添加到已知濃度的標準樣品中。添加后，進行HPLC分析，測定標準樣品與內(nèi)標物的峰面積之比。橫軸為內(nèi)標物質(zhì)的添加比例，縱軸為峰面積比，由此可以求出校準曲線。
HPLC 檢測器和檢測限
各種設(shè)備作為 HPLC 檢測器出售。示例包括紫外-可見光譜 (UV-Vis) 檢測器、熒光檢測器和示差折光檢測器 (RID)。這些檢測器的檢測限根據(jù)樣品的不同而有很大差異。例如，UV-Vis 檢測器的檢測限約為 10 皮克 (pg)，熒光檢測器的檢測限約為 0.1 pg。
最靈敏的方法是質(zhì)譜儀(MS)，估計其檢測靈敏度為 0.01 pg。然而，檢測限取決于樣品中所含化合物的類型和濃度以及分離程度。在某些情況下，可能還需要通過向樣品添加發(fā)射熒光的官能團來“衍生”樣品。如果想要進行高靈敏度的檢測，就需要優(yōu)化HPLC分析，包括樣品前處理。